多色流式細胞術和細胞分選是研究肝巨噬細胞（hepatic m?）的強大免疫學工具，但對于制備肝勻漿以進行這些分析的方法尚無共識。利用巨噬細胞和內皮細胞報告小鼠的組合、流式細胞術和共聚焦成像，我們已經表明，用于識別庫普弗細胞（Kupffer cells, KCs）的常規(guī)流式細胞策略會包括相當比例的CD31高表達肝竇內皮細胞（LSECs）。無論為流式細胞術制備細胞的方法如何，這些內皮細胞均存在，并且代表緊密附著在KC膜殘余上的內皮。針對內皮標志物（如CD31）的抗體對于排除這些細胞至關重要。這一結果將人們的注意力集中在最近發(fā)布的微陣列數據集中，這些數據集顯示與其他組織駐留巨噬細胞相比，KCs高表達與內皮細胞相關的基因。我們的研究還揭示了常用分離方法中KCs在白細胞中顯著且特異性的丟失，這些方法導致增殖性和單核細胞來源的巨噬細胞被富集。因此，我們提出了一種方法，可以高產率地獲得肝髓系細胞，而不會產生細胞類型偏倚或被內皮細胞污染。消除內皮細胞污染及傳統肝庫普弗細胞分離和分析方法中固有的選擇偏倚的實驗方案。
愛丁堡大學Stephen Jenkins團隊用Cdh5-CreERT2 × mTmG報告小鼠。 他們發(fā)現：在肝組織流式分析中，肝臟KF細胞經典的“F4/80高、CD11b低"設門群體中，有10%左右的細胞是CD31高表達的肝竇內皮細胞（LSECs）。這些細胞看似巨噬細胞，卻在顯微鏡下露出真面目—— CD45?F4/80?CD31?的“雙陽"細胞，實為Kupffer細胞殘膜緊貼在內皮表面形成的粘連體（doublets）！
肝臟灌注，酶消化裂解。常用的分離方法是Percoll密度梯度離心法。無論那種方法，包括300g雙離心法和50g慢速預離心法，都能在KCs群中看到“偽Kupffer細胞"——即CD31?污染。 而且，Percoll法雖然被廣泛使用，卻帶來了相對更嚴重的細胞丟失和比例偏倚。Percoll法獲得的Kupffer細胞數比300g法少7倍以上；Ki67陽性比例、骨髓嵌合結果均被高估。因此，建議排除CD31?污染。肝臟庫弗巨噬細胞流式檢測受到內皮細胞干擾F4/80和CD31雙陽。
